交互式流式细胞术染色方案

第一部分：细胞表面染色

🧪

将单细胞悬液转移至 1.5 mL EP 管中。

加入 500 µL 预冷的 FACS Buffer (含1-2% FBS的PBS溶液)，重悬细胞，于 4℃, 1000 × g 离心 5分钟，弃上清。

活/死细胞鉴别 (可选)

用不含蛋白的PBS重悬细胞沉淀。

加入活/死染料，于 4℃ 避光孵育。

加入 500 µL FACS Buffer 终止染色，离心并弃去上清。

抗体孵育

用 20 µL/样本的 Fc Block 溶液重悬细胞，于 4℃ 孵育。

无需洗涤，直接加入 30 µL/样本的表面抗体混合液，轻轻吹打混匀，于 4℃ 避光孵育。

加入 500 µL FACS Buffer 洗涤细胞，离心并弃去上清。

用 200-300 µL 的 1% PFA 重悬细胞以固定。 (如需胞内染色，直接进入下一步)

第二部分：胞内细胞因子染色

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弃去上清，加入 200 µL 固定缓冲液，轻轻吹打混匀，于室温避光孵育。

加入 300 µL 1× 破膜缓冲液，于室温, 1000 × g 离心 5分钟，弃上清。

重复洗涤：加入破膜缓冲液洗涤，离心并弃上清 (第一次重复)。

重复洗涤：再次加入破膜缓冲液洗涤，离心并弃上清 (第二次重复)。

用 50 µL 含胞内抗体的 1× 破膜缓冲液重悬细胞，于室温避光孵育。

加入 500 µL 1× 破膜缓冲液洗涤，离心并弃上清。

用 300 µL 的 1% PFA 重悬细胞，转移至流式管准备上机。

第三部分：关键技巧与避坑

💡

⚠️ 活/死染料

大多数氨基反应性染料需在不含蛋白 (如FBS) 的PBS中进行，否则染料会被淬灭导致染色失败。

⚠️ 离心机选择

强烈不建议使用角转子离心机！尤其在胞内染色中，破膜后的细胞沉淀松散，极易丢失。推荐使用水平转子或96孔V型底板。

第四部分：计算模块

🧮

样品数量 (N):

1. Fc Block 溶液配置

计算结果已包含10%余量。

单个样品Fc Block体积 (µL):

2. 抗体混合液 (Antibody Mix) 配置

计算结果已包含10%余量。点击“+”增加抗体。

抗体1 单个样品体积 (µL):

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